基因合成序列与参考序列存在差异，核心原因可归结为设计阶段的信息偏差、合成过程的技术误差以及组装环节的操作或环境影响三大类。

 

一、设计阶段：源头信息偏差

    设计是基因序列的源头，此阶段的偏差会直接导致最终产物与预期不符。

    参考序列本身错误。所使用的数据库序列（如NCBI）可能存在注释错误、版本更新未同步，或手动录入时出现碱基遗漏、替换。

    人工设计失误。在引物设计、酶切位点添加、密码子优化过程中，可能因手动输入错误（如将A错写为T）、软件参数设置不当（如未避开重复序列）导致偏差。

    格式或信息传递错误。设计文件（如FASTA格式）在传输、转换过程中出现格式损坏，或订单提交时未正确关联目标序列，导致合成的是错误序列。

二、合成阶段：技术流程误差

    基因合成依赖化学合成反应，反应本身的特性和设备精度会引入误差。

    化学合成反应的固有错误。在碱基偶联过程中，可能发生偶联效率不足（导致碱基缺失）、错误偶联（导致碱基替换）或发生移码突变，且错误率会随序列长度增加而累积。

    合成设备精度问题。合成仪的试剂分配精度不足、温度控制不稳定，可能导致局部反应条件异常，增加碱基错配或缺失的概率。

    合成后纯化不彻底。合成产物中残留的未完全偶联片段、杂质核酸，可能在后续步骤中被误判为目标序列，或干扰后续验证结果。

 

三、组装阶段：操作与环境干扰

    对于长片段基因（需分段合成后组装），组装过程是新的误差来源。

    酶促反应误差。使用PCR扩增、连接酶连接时，Taq酶等聚合酶可能引入碱基错配（尤其是在高GC含量区域），连接酶也可能出现连接效率低或错接的情况。

    操作过程污染。实验环境中存在的外源核酸（如其他样品的DNA、气溶胶污染），可能在PCR、电泳等步骤中混入，导致测序结果出现杂峰或错误序列。

    载体与插入片段的错误连接。载体酶切不彻底、插入片段方向颠倒，或多片段组装时出现顺序错乱，都会导致最终序列与参考序列不一致。