基因序列设计需重点规避重复序列、发夹结构、高GC/AT区域等6类风险序列，避免影响扩增、克隆、表达等下游实验效率。

 

一、需重点规避的风险序列及危害

1.重复序列

    类型包括同向重复、反向重复、串联重复（如(AT)n、(CGG)n）。

    危害：导致PCR扩增时引物结合紊乱、DNA聚合酶滑移，引发碱基缺失/插入；克隆时易发生载体-目的基因重组错误，甚至序列丢失。

 

2.二级结构相关序列

    核心是发夹结构（茎环结构），当序列中互补碱基连续配对（如≥6个互补碱基），易形成稳定茎环。

    危害：阻碍PCR引物结合和延伸，降低扩增效率；转录时影响RNA聚合酶移动，导致转录终止或mRNA折叠异常。

 

3.极端GC/AT含量区域

    高GC区域（GC含量＞65%）：易形成GC二聚体、链内交联，导致PCR扩增困难、测序峰图紊乱。

    高AT区域（AT含量＞75%）：DNA双链稳定性差，PCR中易解链不完全，克隆时重组效率低。

 

4.酶切位点相关序列

    规避载体多克隆位点（MCS）中的酶切位点，避免目的基因插入时被误切；同时避免目的基因内部出现与克隆酶、鉴定酶相同的位点。

    危害：导致目的基因断裂、载体自连或重组子构建失败。

 

5.启动子/终止子同源序列

    避免目的基因中出现与表达载体同源的启动子片段、终止子序列（如TAA、TAG、TGA重复）。

    危害：引发转录干扰，导致目的基因表达沉默或异常终止。

 

6.其他风险序列

    限制性内切酶的识别序列（如EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列）、重复酶切位点。

毒性序列（如某些细菌毒素基因片段）、稀有密码子簇（影响蛋白翻译效率）。

二、规避与优化策略

    序列分析工具：使用Primer Premier、OligoCalc、SnapGene等工具，预测重复序列、二级结构（发夹结构的ΔG＜-5kcal/mol需优化）、GC含量（理想范围40%-60%）。

    序列改造原则：对高风险区域进行同义突变，保持氨基酸序列不变（蛋白表达目的），破坏重复碱基配对或二级结构。

    分段设计：超长基因（＞3kb）可分段设计，每段避免出现连续风险序列，分段处避开重复或二级结构区域。

    引物结合区优化：确保引物结合区域无二级结构、无重复序列，GC含量控制在45%-55%，避免引物二聚体。

 

三、实操验证要点

    设计完成后，通过BLAST比对确认序列无同源性干扰（如与载体、宿主基因组的非特异性同源）。

    小片段序列可直接合成验证，长片段建议分段合成后拼接，降低合成失败风险。