硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体的纯度通常在60%–80%（以IgG为目标蛋白），核心杂质为血清白蛋白、转铁蛋白等杂蛋白及残留硫酸铵，后续需通过“脱盐+高分辨率层析”组合步骤，可将纯度提升至95%以上（甚至99%）。

一、硫酸铵沉淀的纯度局限

    硫酸铵沉淀基于蛋白溶解度差异实现初步分离，属于“粗纯化”手段。

    它能有效去除部分小分子杂质和溶解度差异大的杂蛋白，但无法分离与IgG溶解度接近的血清蛋白（如牛血清白蛋白、α2-巨球蛋白）。

    最终产物中仍残留约20%–40%杂蛋白，且含高浓度硫酸铵，会干扰后续实验或应用（如ELISA、细胞实验），必须进一步优化。

二、提升纯度的核心后续步骤（按顺序推荐）

1.第一步：脱盐（必做前置步骤）

    核心目的：去除残留硫酸铵，调节缓冲液环境，为后续层析做准备。
常用方法：凝胶过滤层析（如SephadexG-25）或透析，操作简单且不损失抗体活性。

    关键作用：避免高盐环境影响后续层析介质的结合效率（如离子交换层析对盐浓度敏感）。

 

2.第二步：高分辨率层析（核心纯化步骤，选1–2种组合）

ProteinA/G/L亲和层析（首选）：

    特异性结合IgG的Fc段，对多克隆抗体的富集效果极强，单步可将纯度提升至90%–95%。

    适用于绝大多数哺乳动物IgG（如兔、鼠、人源），操作简单、回收率高，是抗体纯化的“黄金步骤”。

 

离子交换层析（补充优化）：

    常用阳离子交换层析（如SPSepharose），利用IgG与杂蛋白的等电点差异实现分离。

    可去除亲和层析无法分离的微量杂蛋白（如降解的IgG片段、非特异性结合的杂蛋白），将纯度进一步提升至98%以上。

 

疏水相互作用层析（可选，针对高杂质场景）：

    适用于杂蛋白含量较高的样品，利用蛋白疏水性差异分离，可作为亲和层析后的“抛光步骤”，去除微量残留杂质。

 

3.第三步：终端处理（按需选择）

    再次凝胶过滤层析（如SephadexG-100）：去除聚合体（IgG易形成二聚体/多聚体），提升产物均一性。

    超滤浓缩：调节抗体浓度，适配后续应用需求（如1–10mg/mL用于实验，100mg/mL以上用于制剂）。

 

三、典型纯化流程与纯度变化

    硫酸铵沉淀（60%–80%）→脱盐→ProteinA亲和层析（90%–95%）→离子交换层析（98%–99%）→（可选）凝胶过滤层析（99%+，去除聚合体）。