蛋白纯化后的纯度检测需结合不同原理（如分子量、电荷、疏水性等）选择方法，且不同后续实验对纯度的需求差异极大，以下从常用检测方法和不同实验的纯度标准两方面详细说明，同时结合方法的优缺点与适用场景，帮助精准选择。
 

一、蛋白纯化后的常用纯度检测方法

    不同方法的灵敏度、分辨率和适用场景不同，实际实验中常需2-3种方法交叉验证（如SDS-PAGE初筛+HPLC精检），避免单一方法的局限性（如SDS-PAGE无法区分分子量接近的杂质，SEC-HPLC无法判断杂质是否为蛋白）。

 

1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

    核心原理：蛋白在十二烷基硫酸钠（SDS）作用下变性并带均匀负电，通过聚丙烯酰胺凝胶的“分子筛效应”按分子量大小分离；电泳后用考马斯亮蓝（常规染色）或银染（高灵敏染色）显色，通过条带数量判断纯度——若仅出现目标蛋白对应的单一清晰条带，说明纯度较高，若有额外条带则存在杂蛋白。

    优点：操作简单、成本低、结果直观（直接观察条带）；可同时初步验证目标蛋白分子量（与标准分子量蛋白Marker对比）；考马斯亮蓝染色适用于常规纯度筛查（检测限～0.1-1μg），银染灵敏度更高（检测限～1ng），可检出微量杂蛋白。

    缺点：分辨率中等，难以区分分子量差异<5kDa的蛋白（如目标蛋白的降解片段与小杂蛋白）；银染可能出现非特异性染色（如盐、去污剂干扰）；无法区分变性后分子量相同的杂质（如目标蛋白的异构体、修饰体）。

    适用场景：纯化过程中每一步的快速纯度监控（如粗提、层析后）；初步判断是否存在明显杂蛋白（如条带是否单一）；无需极高分辨率的常规实验前筛查。

2、十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳（SDS-CGE）

    核心原理：将“凝胶筛分”与“毛细管电泳”结合，蛋白在毛细管内的凝胶基质中按分子量分离，通过紫外检测或激光诱导荧光检测（灵敏度更高）记录洗脱峰，峰的数量对应蛋白种类，峰面积可定量杂质比例。

    优点：分辨率远高于SDS-PAGE（可区分分子量差异<2kDa的蛋白）；自动化程度高、样品用量极少（仅需μL级）；结果可定量（通过峰面积归一化计算纯度），重复性好，避免了SDS-PAGE染色的主观误差（如条带深浅判断）。

    缺点：仪器成本高（毛细管电泳仪价格昂贵）；对样品预处理要求高（高盐、去污剂会干扰电泳，需提前脱盐）；检测速度较慢（单次实验约30-60分钟）。

    适用场景：需精确判断纯度的场景（如抗体药物、重组蛋白药物的纯度质控）；微量样品（如珍贵蛋白、低表达量蛋白）的纯度分析；需要定量杂质比例的实验前检测。

 

3、高效液相色谱（HPLC）：反相（RP-HPLC）与体积排阻（SEC-HPLC）

    HPLC是高分辨率的精准检测方法，不同类型的HPLC基于不同分离原理，适用于不同杂质的检测：

 

（1）反相HPLC（RP-HPLC）：

    原理：利用蛋白疏水性差异分离——固定相为疏水填料（如C18柱），流动相为水相（含三氟乙酸等）与有机相（如乙腈）的混合液，疏水性强的蛋白与固定相结合更紧密，需更高比例有机相洗脱，通过紫外检测记录峰，单一峰说明纯度高。

    优点：分辨率极高，可区分疏水性/电荷微小差异的杂质（如目标蛋白的磷酸化修饰体、氧化产物）；定量精准（峰面积归一化误差<2%）；可同时分析蛋白的纯度与完整性（如是否有降解片段）。

    缺点：需使用有机相洗脱，可能导致部分蛋白变性（无法用于后续活性实验的样品检测）；对蛋白溶解度要求高（疏水蛋白易在有机相中沉淀，堵塞色谱柱）；色谱柱成本高，需严格维护。

    适用场景：需超高分辨率的纯度检测（如结晶实验前的蛋白均一性验证）；蛋白修饰体（如糖基化、磷酸化）的分离与检测；定量分析微量杂质（如杂质比例<1%）。

 

（2）体积排阻HPLC（SEC-HPLC，又称凝胶过滤HPLC）：

    原理：利用蛋白分子体积差异分离——固定相为多孔凝胶颗粒，小分子蛋白（或杂蛋白、聚合体）可进入凝胶孔隙，洗脱速度慢；大分子目标蛋白无法进入孔隙，洗脱速度快，通过紫外检测记录峰。

    优点：无需变性（流动相为缓冲液），可反映蛋白天然状态下的纯度（如是否存在二聚体、多聚体等聚合杂质）；可同时分析蛋白的分子量分布（与标准分子量蛋白对照）。

    缺点：分辨率低于RP-HPLC，难以分离分子量接近的单体杂蛋白；受样品体积和浓度影响大（需严格控制上样量）；凝胶柱易受污染（需定期清洗）。

    适用场景：检测蛋白的聚合杂质（如抗体药物中的二聚体）；天然状态下的纯度分析（如酶活性实验前的均一性验证）；与RP-HPLC结合，全面评估纯度（RP-HPLC检测单体杂质，SEC-HPLC检测聚合杂质）。

 

4、质谱（MS）分析：基质辅助激光解吸电离（MALDI-TOFMS）与电喷雾电离（ESI-MS）

    核心原理：将蛋白离子化后，根据离子的质荷比（m/z）分离，通过质谱图判断蛋白的分子量与纯度——若仅出现目标蛋白的特征峰，说明纯度高；若有额外峰，则对应杂蛋白或修饰体（如磷酸化、糖基化）。

    优点：灵敏度极高（检测限～fmol级），可检出微量杂蛋白；可同时确定目标蛋白的精确分子量（验证是否存在修饰，如是否有信号肽切除、磷酸化修饰）；能区分同分异构体（如不同糖基化修饰的蛋白）。

    缺点：仪器成本极高（需专业操作）；无法准确定量杂质比例（需结合HPLC等方法）；对样品纯度有一定要求（高盐、去污剂会抑制离子化，需提前脱盐、除杂质）。

    适用场景：高纯度要求实验的最终验证（如蛋白结晶、结构解析前的纯度确认）；分析蛋白的翻译后修饰（如糖基化、磷酸化）；检测极微量杂蛋白（如杂质比例<0.1%）。

 

5、等电聚焦电泳（IEF-PAGE）

    核心原理：利用蛋白的等电点（pI）差异分离——凝胶中形成pH梯度，蛋白在电场中迁移至自身pI对应的pH位置（此时蛋白不带电，停止迁移），通过染色显示条带，单一條带说明蛋白的电荷均一性高（无电荷差异的杂蛋白或修饰体）。

    优点：可检测电荷异质性（如目标蛋白的脱酰胺产物、磷酸化修饰体，这些杂质的分子量可能与目标蛋白接近，但pI不同）；操作相对简单，成本低于HPLC。

    缺点：无法区分pI相同的杂蛋白；对样品浓度要求高（需>0.1mg/mL）；pH梯度易受温度、缓冲液影响，重复性略差。

    适用场景：分析蛋白的电荷均一性（如抗体的电荷异质性检测）；补充SDS-PAGE的不足（SDS-PAGE无法区分电荷差异，IEF可互补）；酶活性实验前的纯度验证（电荷异质性可能影响酶活性）。

 

二、不同后续实验的蛋白纯度要求

    纯度要求的核心取决于实验对“蛋白均一性”的需求——均一性要求越高（如结晶依赖蛋白分子的有序排列），纯度标准越严格；而部分实验（如抗体制备）对微量杂蛋白的容忍度更高。

 

1、蛋白结晶与结构解析（X射线晶体衍射、冷冻电镜）

    核心需求：蛋白需高度均一（无杂蛋白、无聚合体、无修饰异质性），否则会干扰晶体的有序生长（杂蛋白可能占据晶体晶格，导致晶体质量差或无法结晶）。

 

纯度要求：

    常规检测（SDS-PAGE/SEC-HPLC）：纯度需≥95%，且SEC-HPLC无明显聚合体峰（聚合体比例<5%）；

    精准检测（RP-HPLC/MS）：纯度需≥98%，且无明显修饰体（如磷酸化、糖基化异质性）——若为糖蛋白，需额外通过糖基化分析（如糖苷酶酶解+MS）确认糖链均一性；

    特殊情况（膜蛋白、大复合物）：因纯化难度高，纯度可适当放宽至90%-95%，但需确保无明显聚合体（聚合体会严重影响冷冻电镜的颗粒筛选）。

 

2、抗体制备（多克隆抗体、单克隆抗体）

    核心需求：杂蛋白需尽可能少，避免诱导针对杂蛋白的抗体（导致抗体特异性差）；但对纯度的要求低于结晶（少量杂蛋白可通过后续抗体纯化去除）。

 

纯度要求：

    多克隆抗体制备（免疫动物）：SDS-PAGE检测纯度≥85%即可——若杂蛋白比例过高（>15%），可能导致抗血清中杂抗体过多，后续亲和纯化难度增加；

    单克隆抗体制备（杂交瘤筛选）：纯度需≥90%——更高的纯度可减少杂蛋白对杂交瘤筛选的干扰（避免筛选出针对杂蛋白的单克隆抗体）；

    注意：若目标蛋白为膜蛋白或低表达蛋白，纯度可放宽至80%-85%，但需通过WesternBlot验证目标蛋白的特异性（确保免疫原中目标蛋白占比最高）。

 

3、其他常见实验的纯度参考

    酶活性测定：纯度≥90%，且无影响酶活性的杂蛋白（如蛋白酶、激酶——需通过活性抑制实验排除）；

    蛋白相互作用实验（如Pull-down、SPR）：纯度≥95%，避免杂蛋白与靶点非特异性结合（干扰相互作用信号）；

    细胞功能实验（如蛋白转染、信号通路激活）：纯度≥90%，且无内毒素（内毒素会激活细胞的炎症通路，干扰实验结果）。

    蛋白纯度检测需根据实验需求选择合适的方法（如结晶需RP-HPLC+MS，抗体制备需SDS-PAGE+WesternBlot），且纯度标准需结合后续实验的核心需求制定，避免过度纯化（浪费样品和时间）或纯度不足（导致实验失败）。