在抗体定制中，抗原的免疫原性直接决定免疫系统能否有效识别并产生特异性抗体——免疫原性弱会导致抗体效价低、特异性差，甚至无法诱导免疫应答。提升免疫原性的核心思路是增强抗原对免疫系统的“识别信号”（如优化抗原结构、模拟天然免疫场景、打破免疫耐受），需结合抗原类型（如小分子、多肽、蛋白、糖蛋白）的特性选择针对性策略，以下是具体可操作的方法：

 

一、针对“低免疫原性抗原”的结构优化：增强免疫原性核心信号

    部分抗原（如小分子化合物、短肽、高度保守的蛋白）因“结构简单、与宿主同源性高”，难以被免疫系统识别，需通过结构修饰或改造提升其“异物性”和“复杂性”。

 

1、小分子/短肽抗原：通过“载体偶联”补充免疫原性信号

    小分子（如药物、激素、小分子毒素，分子量<1000Da）和短肽（氨基酸残基<20个）通常无独立免疫原性（仅能作为“半抗原”，无法激活T细胞），必须与载体分子偶联，借助载体的免疫原性激活T细胞，进而诱导B细胞产生针对半抗原的抗体。

 

（1）常用载体选择：

    牛血清白蛋白（BSA）：最常用载体，分子量约66kDa，含丰富赖氨酸（便于偶联），免疫原性强，适用于多数小分子/短肽的偶联；

    钥孔血蓝蛋白（KLH）：分子量更大（约4.5×10⁶Da），含更多半胱氨酸（可通过巯基偶联），免疫原性比BSA更强，尤其适合“弱免疫原性短肽”（如与宿主同源性高的肽段）；

    卵清蛋白（OVA）：常用于“二次免疫验证”（如用BSA偶联抗原免疫，OVA偶联抗原检测抗体特异性，避免抗体针对载体）。

 

（2）偶联关键注意事项：

    确保半抗原与载体的“偶联位点不覆盖抗原表位”（如短肽的抗原表位是N端序列，则选择C端赖氨酸偶联），避免掩盖关键识别位点；

    控制偶联比例（如小分子：载体=10:1~20:1），比例过低会导致免疫原性不足，过高可能引发载体免疫耐受。

 

2、高度保守/同源性高的蛋白抗原：打破免疫耐受

    若目标蛋白与免疫动物（如小鼠、兔）的同源性高（>80%），免疫系统会将其视为“自身成分”，产生免疫耐受，难以诱导抗体。可通过以下方式打破耐受：

    选择低同源性的免疫动物：例如，若人源蛋白与小鼠同源性高，可改用兔（人与兔的蛋白同源性通常低于人与小鼠）或鸡（禽类与哺乳动物的蛋白同源性更低）作为免疫动物；

    片段化抗原（暴露保守蛋白的非保守区域）：通过酶解（如胰蛋白酶水解）或基因工程表达（仅表达蛋白的非保守结构域，如胞外区、功能域），避免保守区域引发的免疫耐受；

    引入化学修饰（改变蛋白结构）：用甲醛、戊二醛等轻度交联蛋白，或通过磷酸化、糖基化修饰（模拟蛋白的翻译后修饰），改变蛋白的空间结构，增强其“异物性”。

 

3、可溶性差/聚合性低的蛋白抗原：提升抗原的呈递效率

    免疫系统对“聚合态抗原”的识别效率远高于“单体抗原”（聚合态抗原更易被树突状细胞捕获并呈递）。若抗原可溶性差或易单体化，可通过以下方式优化：

    优化缓冲液（提升可溶性与稳定性）：添加温和的去污剂（如0.1%TritonX-100）、盐类（如150mMNaCl）或稳定剂（如甘油、蔗糖），减少抗原沉淀，维持其天然构象；

    诱导抗原聚合（增强免疫原性）：用戊二醛（轻度交联）或碳化二亚胺（EDC，交联氨基与羧基）诱导抗原形成低聚体（如二聚体、三聚体），但需注意控制交联程度，避免过度聚合导致抗原表位被掩盖；

    与免疫佐剂预混合（辅助抗原呈递）：将抗原与佐剂（如弗氏佐剂）混合后形成乳浊液，佐剂可包裹抗原，缓慢释放并激活抗原呈递细胞，间接提升抗原的呈递效率。

二、借助“免疫佐剂”：激活免疫系统的“共刺激信号”

    免疫佐剂本身无特异性，但能通过激活固有免疫系统（如激活巨噬细胞、树突状细胞），提供“共刺激信号”，增强抗原对免疫系统的刺激强度，是提升免疫原性的“核心辅助手段”。选择合适的佐剂需结合抗原类型、免疫动物和实验需求（如是否需要高抗体效价、是否避免炎症反应）。

 

1、常用佐剂类型及适用场景

    弗氏佐剂（Freund'sAdjuvant）：最经典的佐剂，分为“完全佐剂（CFA）”和“不完全佐剂（IFA）”：

    完全佐剂（CFA）：含灭活的分枝杆菌（如卡介苗），可强烈激活Th1型免疫应答（促进细胞免疫和IgG2a类抗体产生），适用于“弱免疫原性抗原”（如短肽、保守蛋白）的初次免疫；

    不完全佐剂（IFA）：不含分枝杆菌，免疫原性较弱，适用于后续加强免疫（避免CFA反复使用导致的严重炎症反应，如局部脓肿）；

    注意：仅适用于动物免疫（如小鼠、兔），严禁用于人体；需与抗原充分乳化（形成油包水乳浊液），否则佐剂效果大幅下降。

    铝佐剂（AlumAdjuvant）：安全温和的佐剂（如氢氧化铝、磷酸铝），通过“吸附抗原”缓慢释放，激活Th2型免疫应答（促进IgG1、IgE类抗体产生），适用于：
对炎症反应敏感的动物（如豚鼠、大鼠）；

    需避免强炎症的场景（如后续需收集动物血清进行功能实验）；

    缺点：免疫原性弱于CFA，对小分子/短肽抗原的辅助效果有限。

 

新型佐剂（针对特殊需求）：

    CpG寡核苷酸（CpGODN）：模拟细菌DNA的免疫刺激序列，激活Toll样受体9（TLR9），增强Th1型免疫应答，适用于“需要高特异性IgG抗体”的场景（如中和抗体制备）；

    脂质体佐剂：将抗原包裹在脂质体中，模拟天然病原体的膜结构，提升抗原的靶向性（如靶向树突状细胞），适用于“可溶性蛋白抗原”或“糖蛋白抗原”。

 

2、佐剂使用的关键原则

    初次免疫用强佐剂，加强免疫用弱佐剂：如初次用CFA，后续2-3次加强用IFA，避免长期强佐剂刺激导致动物免疫耐受或组织损伤；

    佐剂与抗原充分乳化：尤其是油包水型佐剂（如CFA/IFA），乳化不充分会导致抗原释放过快，无法持续刺激免疫系统，可通过“滴入水中不扩散”判断乳化是否充分；

    控制佐剂用量：通常佐剂与抗原体积比为1:1（如50μL抗原+50μLCFA），过量佐剂会增加动物毒性（如体重下降、局部炎症）。

 

三、优化“免疫策略”：模拟天然免疫应答的时序与强度

    合理的免疫程序（如免疫剂量、免疫间隔、免疫途径）可最大化激活免疫系统，避免因“刺激不足”（剂量过低）或“过度刺激”（剂量过高导致耐受）影响抗体产生。

 

1、选择合适的免疫动物：匹配抗原与动物的免疫特性

    不同动物的免疫系统对同一抗原的应答差异较大，需根据抗原类型和抗体需求选择：

    兔（如新西兰大白兔）：适用于制备多克隆抗体，免疫系统成熟，抗体效价高、持续时间长（血清量多，可长期收集），尤其适合“大分子蛋白抗原”或“KLH偶联的短肽抗原”；

    小鼠（如BALB/c小鼠）：适用于制备单克隆抗体（杂交瘤技术常用），免疫周期短（约4-6周），但血清量少，适合“小分子偶联抗原”或“高同源性蛋白抗原”（需选择低同源性小鼠品系）；

    鸡（如SPF鸡）：适用于“人源保守蛋白抗原”（禽类与哺乳动物同源性低，易打破免疫耐受），可从鸡蛋中收集抗体（IgY），无需采血，适合长期大量制备。

 

2、控制免疫剂量：避免“剂量不足”或“免疫耐受”

    蛋白抗原：兔的单次免疫剂量通常为100-200μg/只，小鼠为20-50μg/只；若抗原免疫原性强（如细菌蛋白），可降至50-100μg（兔）、10-20μg（小鼠）；

    短肽/小分子偶联抗原：因偶联后分子量增大，剂量可参考蛋白抗原（如兔100μg/只，小鼠20μg/只），但需确保偶联后的“有效抗原量”（如短肽占偶联物的10%，则100μg偶联物含10μg短肽）；

    原则：剂量过低会导致免疫应答弱，剂量过高（如超过500μg/只兔）会引发B细胞免疫耐受，反而无法产生抗体。

 

3、优化免疫间隔与次数：确保免疫系统持续激活

    免疫间隔：初次免疫后，间隔2-3周进行第一次加强免疫，后续每2周加强1次，共加强2-3次（总免疫次数4-5次）；间隔过短（<1周）会导致免疫系统未充分活化，间隔过长（>4周）会导致记忆细胞衰退；

    采血检测：最后一次加强免疫后10-14天，采集少量血清（兔1-2mL，小鼠50-100μL），通过ELISA检测抗体效价（如效价>1:10⁴，说明免疫成功），若效价低，可追加1次加强免疫；

    融合/采血时机：制备单克隆抗体时，在最后一次加强免疫后3-5天进行杂交瘤融合（此时脾脏中分泌抗体的B细胞数量最多）；制备多克隆抗体时，在效价达到峰值后大量采血。

 

四、特殊抗原的针对性策略（糖蛋白、膜蛋白）

1、糖蛋白抗原：保留糖链结构，增强糖表位免疫原性

    糖蛋白的抗原表位可能包括“蛋白表位”和“糖链表位”（如病毒包膜糖蛋白的糖链），若需诱导针对糖链的抗体，需避免纯化过程中糖链被破坏：

    温和纯化条件：避免使用高浓度变性剂（如8M尿素）或强酸强碱，选择pH6.0-8.0的缓冲液，维持糖链的完整性；

    选择针对糖链的免疫佐剂：如含植物凝集素（如刀豆蛋白A）的佐剂，可特异性结合糖链，增强糖表位的呈递效率；

    用糖基化酶修饰（若需针对蛋白表位）：若仅需诱导针对蛋白骨架的抗体，可先用糖苷酶（如PNGaseF）去除糖链，避免糖链干扰蛋白表位的识别。

 

2、膜蛋白抗原：维持天然构象，减少变性

    膜蛋白（如G蛋白偶联受体、离子通道）因含疏水跨膜区，易变性且可溶性差，其免疫原性依赖天然构象：

    用去垢剂维持可溶性：选择温和的去垢剂（如十二烷基麦芽糖苷DDM、辛基葡糖苷OG），浓度高于临界胶束浓度（CMC），避免膜蛋白聚集变性；

    通过载体展示天然构象：将膜蛋白嵌入脂质体或纳米盘（由载脂蛋白和磷脂组成的圆盘结构），模拟其在细胞膜上的天然状态，增强构象表位的免疫原性；

    表达胞外区片段：若膜蛋白跨膜区纯化难度大，可通过基因工程仅表达胞外区（水溶性好，且含主要抗原表位），降低纯化难度并提升免疫原性。

 

总结：提升抗原免疫原性的核心逻辑

    先判断抗原类型：小分子/短肽需偶联载体，保守蛋白需打破耐受，膜蛋白需维持构象；

    再匹配佐剂与免疫策略：弱免疫原性抗原用强佐剂（如CFA）+多次加强，敏感动物用温和佐剂（如铝佐剂）+适宜剂量；

    最后验证优化：通过ELISA检测抗体效价，若效价低，可调整佐剂类型、免疫次数或抗原结构（如重新设计短肽、更换载体）。

    通过以上策略，可显著提升抗原的免疫原性，为后续制备高效价、高特异性的抗体奠定基础。