密码子偏好性是不同物种对编码同一氨基酸的同义密码子存在的非随机使用倾向，在基因合成中，这种偏好性直接决定外源基因在宿主中的表达效率，是密码子优化的核心依据；而原核、真核宿主的调控机制差异，也使得二者的优化策略侧重点截然不同。

一、密码子偏好性在基因合成中的体现

1、影响翻译速率与效率

    每个宿主的tRNA库丰度都与其固有密码子偏好高度匹配：高频密码子对应细胞内丰度高的tRNA，低频密码子对应丰度低的tRNA。若基因合成时直接采用外源基因的原始密码子（比如将人源基因直接合成用于大肠杆菌表达），翻译过程中会频繁遇到宿主稀有密码子，导致核糖体因tRNA供给不足而停顿，不仅降低翻译速率，还可能引发新生肽链错误折叠。

    通过基因合成优化密码子，将稀有密码子替换为宿主的高频密码子，能让核糖体持续高效运转，显著提升蛋白表达量。

 

2、调控mRNA稳定性

    密码子的组成会影响mRNA的二级结构和降解速率。例如，连续的低频密码子可能促使mRNA折叠成不稳定的茎环结构，被宿主RNA酶识别并降解。

    在基因合成阶段，通过替换这类不利密码子，可优化mRNA的二级结构，减少其被降解的概率，延长半衰期，间接提高蛋白表达水平。

 

3、规避隐性调控元件

    部分低频密码子或其组合可能隐含宿主的隐性调控序列。在基因合成时，需通过密码子替换剔除这些序列，避免外源基因的转录、翻译被错误调控，保证表达过程的顺畅。

二、原核宿主与真核宿主的密码子优化策略差异

1.原核宿主（以大肠杆菌为代表）的优化策略

    核心依据：参考大肠杆菌高表达基因的密码子使用频率表，优先替换为tRNA丰度前20%的高频密码子，同时严格控制基因整体GC含量在40%–60%，避免局部GC过高（>70%）或过低（<30%），防止影响DNA的复制和转录。

    关键调控序列规避：重点剔除潜在的SD序列（AGGAGG），避免与核糖体16SrRNA错误结合；减少连续的A/T富集区，防止形成rho因子依赖的转录终止位点；同时避免内部的启动子、操纵子序列，防止转录被提前终止或异常调控。

    密码子使用特点：对高频密码子的使用可更“激进”，大面积替换低频密码子，但需避免完全同质化的密码子，防止特定tRNA库被过度消耗而失衡。

    特殊优化点：着重避免连续的稀有密码子簇（如连续的精氨酸稀有密码子CGG/CGA），这是导致大肠杆菌翻译停滞的主要诱因。

 

2.真核宿主（以酵母、哺乳动物细胞为代表）的优化策略

    核心依据：不同真核物种的密码子偏好差异较大，优化时需精准匹配特定宿主管家基因的密码子偏好。比如酵母和人类的密码子偏好截然不同，不能混用优化标准；哺乳动物细胞更关注密码子适应指数（CAI），而非单纯的GC含量，酵母则需将GC含量调控至38%–42%，与宿主自身基因一致。

    关键调控序列规避：重点剔除隐性剪接供体/受体位点（如GT-AG序列），防止mRNA被错误剪接；严格避免polyA信号（如AAUAAA），防止转录提前终止；同时优化mRNA的5'UTR和3'UTR的二级结构，提升翻译起始效率。

    密码子使用特点：更注重密码子使用的均衡性，不能完全替换为最高频密码子，需兼顾不同tRNA的周转效率，避免过度消耗某一类tRNA；哺乳动物细胞还需考虑密码子的“上下文效应”，即相邻密码子的组合对翻译延伸的影响。

    特殊优化点：除了避免稀有密码子簇，还需重点优化翻译起始区，比如修饰ATG周边的Kozak序列（理想序列为GCCRCCATGG），提高核糖体对起始密码子的识别效率，这是决定真核基因翻译起始效率的关键因素。

 

    密码子优化并非替换所有低频密码子即可，过度优化反而可能导致tRNA竞争失衡，降低表达量。通常需以密码子适应指数（CAI）作为评估标准，CAI越接近1，说明优化后的基因与宿主偏好性越匹配。此外，哺乳动物细胞的优化比酵母更复杂，不同细胞系（如CHO细胞与HEK293细胞）的密码子偏好还存在细微差异，需要针对性调整。