化学法DNA合成的主流技术 “固相亚磷酰胺三酯法” 通过在固相载体上逐步偶联核苷酸单体构建DNA链，其核心是利用保护基团调控反应特异性，实现核苷酸从3' 端向5' 端的定向延伸。以下是其逐步偶联的实现方式及核心反应步骤：

一、核苷酸单体的偶联原理

每个核苷酸单体（亚磷酰胺单体）包含三个关键部分：

    5'- 羟基：被二甲氧基三苯甲基（DMT） 保护，避免提前参与反应；

    3'- 磷酸基团：以亚磷酰胺三酯形式存在（含活化基团），可与另一核苷酸的 5'- 羟基反应；

    碱基：含氨基保护基团（如胞嘧啶用乙酰基，腺嘌呤和鸟嘌呤用异丁酰基），防止碱基参与副反应。

    合成时，通过移除保护基团暴露反应位点，使单体通过 3'- 磷酸基团与前一个核苷酸的 5'- 羟基形成磷酸二酯键，实现定向偶联，且整个过程在固相载体（如 CPG 树脂）上进行，便于分离和洗涤。

二、核心反应步骤（以单链DNA合成为例）

1、固相载体预处理

    第一个核苷酸（3' 端起始单体）通过 3'- 羟基共价连接到固相载体（如 CPG 树脂）上，其 5'- 羟基被 DMT 保护，碱基上的氨基被封闭，确保仅 3' 端固定，5' 端可参与后续反应。

2、脱保护（去三苯甲基）

    用三氟乙酸（TFA）处理载体上的核苷酸，选择性去除 5'- 羟基的 DMT 保护基团，生成游离的 5'- 羟基（反应式：DMT-O-5' → HO-5' + DMT+）。DMT 阳离子呈橙色，可通过紫外监测脱保护效率，确保反应完全。

（1）偶联反应

    将活化的亚磷酰胺单体（含下一个碱基）与载体上的核苷酸反应：

        单体在活化剂（如四唑或苯并三唑类化合物）作用下，3'- 亚磷酰胺基团形成活性中间体；

        活性中间体与前一个核苷酸的 5'- 羟基发生亲核取代反应，形成亚磷酸三酯键（连接两个核苷酸）。

        此步骤偶联效率需达 99% 以上，反应时间通常为 20-30 秒，是决定 DNA 合成长度和纯度的关键。

（2）盖帽（Capping）

    用乙酸酐和 N-甲基咪唑处理未反应的5'- 羟基，使其乙酰化（形成O-乙酰基），避免这些游离羟基在后续循环中参与非特异性偶联，减少短片段杂质（如n-1、n-2长度的片段）。

（3）氧化

    用碘的四氢呋喃溶液（含吡啶和水）处理亚磷酸三酯键，将其氧化为稳定的磷酸二酯键（DNA骨架的特征结构），防止后续步骤中的水解断裂。

（4）循环延伸

    重复步骤 2-5（脱保护→偶联→盖帽→氧化），按预设序列依次添加核苷酸，使 DNA 链从 3' 端向 5' 端逐步延长，直至达到目标长度。

（5）切割与脱保护

    合成完成后，用浓氨水（55℃处理 12-16 小时）将 DNA 链从固相载体上切割下来，并去除：

        碱基上的氨基保护基团（如乙酰基、异丁酰基）；

        磷酸基团上的保护基团（如氰乙基）。

        最终获得带游离5'-和3'-羟基的完整DNA链。

（6）纯化

    通过脱盐、PAGE或HPLC纯化，去除短片段、未完全脱保护的杂质及盐类，得到高纯度的DNA产物。

    固相亚磷酰胺三酯法通过 “保护 - 脱保护 - 偶联 - 稳定化” 的循环反应，在固相载体上实现了DNA的精准合成。其核心优势是可自动化操作、合成效率高（每步偶联效率>99.5%），且能通过控制单体添加顺序实现任意序列的定制化合成，是目前化学法DNA合成的金标准技术。