酵母质粒小提的核心是先破除酵母细胞壁释放质粒，再通过核酸吸附柱完成质粒的分离纯化，操作流程及各关键步骤的先后顺序如下：

一、 酵母质粒小提完整操作流程

1、酵母菌体培养与收集

    挑取单菌落接种至含对应抗生素的酵母选择性液体培养基（如 SD 培养基）中，30℃、200–250 rpm 振荡培养 12–16 h 至菌液浑浊（OD₆₀₀≈1.0–1.5）。

    取 1–5 mL 菌液于离心管中，室温下 8000 rpm 离心 1 min，弃尽上清，收集菌体沉淀。

2、酶解破壁（关键步骤，破除酵母细胞壁）

    向菌体沉淀中加入 200 μL 预冷的酵母重悬液（含山梨醇、EDTA，维持渗透压），剧烈涡旋重悬菌体至无明显沉淀。

    加入 10 μL 溶壁酶（如裂解酶 Lyticase，终浓度 2–5 U/μL）或蜗牛酶，轻轻颠倒混匀，30℃水浴孵育 15–30 min，直至菌体悬液变清亮（镜检可见原生质体）。

    室温 8000 rpm 离心 5 min，弃上清，原生质体沉淀用 200 μL TE 缓冲液轻洗一次，再次离心弃上清。

 

3、菌体裂解（释放质粒 DNA）

    向原生质体沉淀中加入 200 μL 裂解液（含 SDS 和 NaOH），温和颠倒离心管 4–6 次，室温静置 2–5 min，此时溶液会变粘稠（注意避免剧烈涡旋，防止基因组 DNA 断裂污染）。

    加入 150 μL 中和液（如醋酸钾缓冲液，pH 4.8），迅速温和颠倒混匀，此时会出现白色絮状沉淀（为变性的蛋白质、基因组 DNA 和细胞碎片）。

 

4、杂质去除与上清收集

    冰浴 5 min 促进杂质沉淀，室温下 12000 rpm 离心 10 min，取上清液转移至新的离心管中（避免吸到白色沉淀）。

 

5、质粒结合（核酸吸附柱结合质粒）

    向上清液中加入 0.6–1 倍体积的无水乙醇或结合液，轻轻颠倒混匀。

    将混合液全部转移至核酸吸附柱中（吸附柱置于收集管上），室温 10000 rpm 离心 1 min，弃收集管中的废液。

 

6、洗涤（去除杂蛋白、盐离子等杂质）

    向吸附柱中加入 500 μL 洗涤液（含乙醇），室温 10000 rpm 离心 1 min，弃废液。

    重复洗涤步骤 1 次，之后空柱离心 2 min，彻底去除残留的洗涤液（乙醇残留会抑制后续酶切、转化等实验）。

 

7、洗脱（获得纯净质粒 DNA）

    将吸附柱转移至新的 1.5 mL 离心管中，向吸附膜中央滴加 30–50 μL 洗脱液（如 TE 缓冲液或 RNase-free 水，pH 8.0–8.5），室温静置 2–5 min。

    室温 10000 rpm 离心 1 min，离心管中的液体即为酵母质粒溶液，可置于 -20℃ 或 -80℃ 保存。

 

二、 酶解破壁、裂解、结合、洗涤、洗脱的先后顺序

1、酶解破壁 → 裂解 → 结合 → 洗涤 → 洗脱

    这个顺序的逻辑是：酵母有坚硬的细胞壁，必须先酶解破壁释放原生质体，才能通过后续的裂解步骤破坏细胞膜、释放质粒；释放的质粒需先与吸附柱结合实现初步分离，再通过洗涤去除杂质，最后洗脱获得高纯度质粒。

 

2、关键注意事项

    酶解破壁的时间需根据菌体状态调整，时间过短细胞壁未完全破除，质粒得率低；时间过长可能导致原生质体破裂、基因组 DNA 释放污染。

裂解和中和步骤需温和操作，避免剧烈涡旋，防止基因组 DNA 断裂成小片段与质粒共纯化。

洗涤后需空柱离心彻底去除乙醇，否则会影响后续实验（如转化效率下降、酶切失败）。